端粒酶活性檢測試劑盒

【產品規格】

BPT50  50T（50人份，分五個**包裝）

【產品說明】

端粒酶活性檢測試劑盒（Telomerase）是一種酶促核糖**白復合物。其催化亞基（TERT）具有逆轉錄酶的特性，TERT被認為是端粒酶活性表達的關鍵組分，其編碼的mRNA水平與端粒酶活性一致，與端粒酶的活化程度密切相關。因此，對端粒酶催化亞基的檢測可以間接反映樣本中端粒酶活性。

本產品試劑KIT采用雙色熒光qPCR（TaqMan探針法）檢測端粒酶催化亞基TERT基因和內參基因***DH。通過提取細胞RNA，利用特異性逆轉錄引物進行逆轉錄反應，以cDNA為模板在單管中利用多重熒光定量PCR進行擴增反應（雙重探針：FAM、Cy5）。選用293T細胞為陽性對照以及MRC-5細胞為陰性對照，通過??CT法檢測樣本中TERT基因的相對表達量。該試劑KIT具有以下特點：

1. 靈敏：雙色探針，靈敏度高。

2. 穩定：全程閉管操作，無交叉污染。

3. 可靠：含內參基因，避免假陰性。

4. 方便：操作簡單，無需電泳步驟。

5. 定量：以CT值判斷，可定量檢測。

【端粒酶活性檢測試劑盒運輸及保存條件】

低溫冷凍運輸，避光-20℃保存，保質期6個月。開蓋后，4℃保存，保質期1周。

【產品組分】

注：1.本試劑盒提供試劑，使用前先低速離心、后小心開啟。使用時請上下輕柔顛倒十次混勻，避免起         泡，并低速短暫離心后使用；

2.為了避免反復凍融，10 人份/管作為一個包裝。

【操作步驟】

1. 逆轉錄反應

使用Trizol法抽提細胞RNA，RNA純度A260/280在1.9-2.0之間。取1ug RNA使用Thermo逆轉錄試劑KIT（貨號：K1622），將試劑KIT中的Random Primer替換成Biowing®Specific Reverse Transcription  Primers進行反轉錄反應得到cDNA。

1.1 DNase I處理

                 反應程序：37℃ 30min；加EDTA 1 µL 后，65℃，10min

1.2 逆轉錄反應      

反應程序：20℃ 10min；42℃ 1h；72℃ 5min

2. qPCR反應體系及條件

2.1 陽性對照處理

將陽性對照cDNA進行2倍、4倍的梯度稀釋，每個梯度建議三重復。

2.2 陰性對照處理

將陰性對照cDNA進行2倍、4倍的梯度稀釋，每個梯度建議三重復。

2.3 樣本處理

將待測樣本cDNA進行2倍稀釋作為測試濃度，每個樣本做三重復。

  反應體系（以20µL為例）      

PCR儀設置（以ABI 7500為例）      

【基線設置】（以ABI 7500為例）

一般默認起始和終止基線位置為3-15個循環，應根據內參基因和TERT基因實際擴增曲線手動將基線起始循環數調整為指數增長期之前即可。

【閾值設置】（以ABI 7500為例）

內參閾值設定：以陽性對照2倍稀釋cDNA定內參基因擴增曲線閾值，內參基因(Cy5)初始濃度的CT值定為16±3；

TERT閾值設定：以陽性對照2倍稀釋cDNA定TERT基因擴增曲線閾值，TERT基因(FAM)初始濃度CT值的定為25±3。

【結果判讀】

圖1 左:陽性293T細胞的擴增曲線；右:陰性MRC-5細胞的擴增曲線

     （藍色為TERT基因曲線,黃綠色為內參基因曲線）

1. 陽性對照2倍稀釋后TERT基因Ct值在 25±3，內參基因Ct值在16±3，4倍稀釋后TERT基因Ct值               在26±3，內參基因Ct值在17±3。

TERT基因和內參基因之間?CT維持在9±3，保持穩定。

2. 陰性對照經2倍、4倍梯度稀釋后，TERT基因Ct值≥35（或檢測不到），內參基因Ct值仍在13-20之間，判定為端粒酶活性為陰性。

3. 結果說明

若待測樣本內參基因Ct值在13-19之間，TERT基因Ct值＜35且擴增曲線正常，則樣本端粒酶活性為陽性。

若待測樣本內參基因Ct值在13-19之間，TERT基因Ct值≥35且無明顯的擴增曲線則樣本無端粒酶活性。

【說明】

1. 待測樣本cDNA 2倍稀釋作為模板，三次技術重復，不設置梯度稀釋；陽性對照、陰性對照進行2倍、4倍梯度稀釋，建議分別做三重復；避免偶然誤差的產生。

2. 如果陽性/陰性對照2倍稀釋后內參基因Ct值＞19，表明參考品有降解或者試劑盒擴增效率下降。

3. 如果所有樣本2倍稀釋后內參基因Ct值＞19，表明試劑盒的擴增效率下降。

4. 如果陽性對照2倍稀釋后TERT基因Ct值＞28，表明TERT基因檢測系統失效。