生物制藥領(lǐng)域支原體檢測(cè)的主流方法

生物制藥領(lǐng)域支原體檢測(cè)的主流方法

在生物制藥領(lǐng)域，支原體污染可能影響產(chǎn)品安全性和有效性，因此檢測(cè)方法需具備高靈敏度、特異性和可靠性。目前該領(lǐng)域支原體檢測(cè)的主流方法如下：

一、核酸擴(kuò)增法（NAT-PCR ）

原理：通過設(shè)計(jì)針對(duì)支原體保守基因的特異性引物，利用 PCR 或?qū)崟r(shí)熒光定量 PCR（qPCR）技術(shù)擴(kuò)增樣本中的支原體核酸，通過熒光信號(hào)或電泳結(jié)果判斷是否存在污染。
特點(diǎn)（qPCR法）：

靈敏度高：配合抽提方案，可檢測(cè)低至 10¹ CFU/mL 的支原體。

速度快：2-4 小時(shí)內(nèi)可出結(jié)果，優(yōu)于傳統(tǒng)培養(yǎng)法。

特異性強(qiáng)：引物針對(duì)支原體序列，減少其他微生物干擾。

適用范圍廣：可檢測(cè)細(xì)胞培養(yǎng)上清、發(fā)酵液、純化產(chǎn)物等多種樣本類型。
應(yīng)用場(chǎng)景：生物制藥生產(chǎn)過程中的中間產(chǎn)物，以及細(xì)胞庫(kù)、培養(yǎng)基的常規(guī)監(jiān)控。

二、支原體培養(yǎng)法（經(jīng)典金標(biāo)準(zhǔn)）

原理：將樣本接種于含血清、酵母提取物等營(yíng)養(yǎng)成分的特殊培養(yǎng)基（如 Hayflick 培養(yǎng)基、PPLO 培養(yǎng)基）中，在適宜溫度（35-37℃）和氣體環(huán)境下培養(yǎng)，觀察是否出現(xiàn)典型的 “油煎蛋" 狀菌落。
特點(diǎn)：

準(zhǔn)確性高：可直接培養(yǎng)并鑒定活支原體，是藥典（如《中國(guó)藥典》3301 支原體檢查法）規(guī)定的參考方法。

可進(jìn)行藥敏試驗(yàn)：若培養(yǎng)陽性，可進(jìn)一步測(cè)試抗生素敏感性，指導(dǎo)污染處理。

缺點(diǎn)：培養(yǎng)周期長(zhǎng)（需 21 天以上），操作復(fù)雜，對(duì)實(shí)驗(yàn)室環(huán)境和技術(shù)要求高。
應(yīng)用場(chǎng)景：用于法規(guī)要求的最終產(chǎn)品放行檢測(cè)。

三、指示細(xì)胞法

原理：是一種通過觀察特定細(xì)胞（指示細(xì)胞）在支原體污染后的形態(tài)或功能變化，來間接檢測(cè)支原體的方法。

特點(diǎn)：

直觀性：通過細(xì)胞形態(tài)或代謝變化直接反映支原體感染，無需復(fù)雜儀器，適合基層實(shí)驗(yàn)室。

模擬生理環(huán)境：指示細(xì)胞與支原體的相互作用更接近實(shí)際感染場(chǎng)景，可檢測(cè)部分難以用核酸或培養(yǎng)法發(fā)現(xiàn)的苛養(yǎng)型支原體。

缺點(diǎn)：需較高濃度的支原體（10?-10? CFU/mL）才能觀察到明顯變化，易漏檢早期或低水平污染；耗時(shí)較長(zhǎng)，共培養(yǎng)需 3-7 天；特異性差，結(jié)果判斷易受人為因素影響。

應(yīng)用場(chǎng)景：初步篩查，在缺乏 PCR 設(shè)備的實(shí)驗(yàn)室中，作為支原體污染的初篩手段，尤其是細(xì)胞培養(yǎng)過程中的日常監(jiān)控。

幾種方法的對(duì)比