多重qPCR中的無中生有：熒光通道間的交叉干擾

以往的qPCR檢測多為單重檢測，隨著檢測技術的發展，多重qPCR因能顯著提升效率（省時省力）而于臨床檢測中越發受到關注。然而，多重qPCR實驗也會面臨一些技術挑戰，其中之一便是“漏光"現象——即熒光通道間的交叉干擾。了解并克服它是獲取可靠結果的關鍵。

一、問題的發現：并非擴增的“擴增曲線"

在一次實驗中（算法：相對熒光值法-log），我們進行了三重體系的擴增檢測。奇特的是，雖然只在體系中加入了FAM通道的模板，HEX通道卻也出現了明顯的擴增曲線。這顯然不符合預期。檢查原始曲線后確認，HEX通道實際上并無真實的擴增信號。

擴增曲線圖（相對熒光值法-log）：

原始曲線圖：

二、問題的來源：算法與物理特性的雙重影響

經過分析與多方咨詢，問題主要來自于兩方面：

1.算法影響：擴增曲線算法選擇了“相對熒光值法-log"，此算法的優點在于能更清晰地顯示出微弱的擴增信號（尤其適用于多重實驗中信號強度變化差異大的情況，此時若是選擇與原始曲線差異不大的絕Abs olute對 Quantification熒光值法便可能會誤導結果判讀）。

擴增曲線-絕Abs olute 對Quantification熒光值法：

可以看到絕Abs olute對 Quantification熒光值法下的擴增曲線HEX很平坦，但仍與閾值線有交叉。

2.物理特性：熒光染料的發射光譜并非特點典型的單峰，而是具有一定寬度的“波包"。這導致相鄰通道（如FAM & HEX/VIC, CY5 & ROX）間存在一定程度的光譜重疊，從而產生信號干擾（通常低于1%，但也存在儀器間差異，建議定期校準儀器）。

下面用這次實驗中的FAM和HEX通道的原始曲線熒光強度做個展示。

FAM通道原始曲線13循環處熒光：

FAM通道原始曲線35循環處熒光：

HEX通道原始曲線13循環處熒光：

HEX通道原始曲線35循環處熒光：

本次實驗中HEX受到FAM“漏光"的程度：（46.69-20.62）/（4635.65-2580.53）=0.0127。

三、問題的優化策略

熒光光譜重疊是物理本質，雖難以消除，但可通過策略盡可能減少干擾影響：

1.結合實驗設計忽略無模板通道：

在已知特定通道無目標模板的多重檢測（如同系列實驗或固定試劑盒方案）中，明確忽略該通道結果即可。

2.原始曲線輔助判讀是關鍵：

無論算法如何處理，原始曲線代表了儀器探測到的原始熒光信號。當擴增曲線形態異常（如本例或基線設置不當導致時），回歸原始曲線是判斷真偽擴增的關鍵。

3.儀器定期校準：

按照儀器制造商的要求進行定期校準，好的設備是保障實驗正常開展的基礎。

4.巧妙避免算法影響：

相對熒光值算法利用了除法放大信號變化，這樣一來若是本底信號本身夠強（比如預載相應探針），便能有效覆蓋交叉干擾帶來的本底變化，使得在相對熒光值法下，該通道也能保持明顯的非擴增狀態。

下面是來自上海翼和SPF級大小鼠國標病原體檢測系列試劑盒的“國標必檢病毒聯檢"項目的陽性對照PC3，該陽性對照無ROX通道模板，但由于聯檢試劑盒ROX通道有對應探針，本底信號覆蓋了干擾。

翼和國標必檢病毒聯檢PC3擴增曲線（相對熒光值法-log）：

翼和國標必檢病毒聯檢PC3原始曲線：