RT-PCR方法--端粒酶活性檢測(cè)

檢測(cè)意義

1、臨床上：觀測(cè)是否有腫瘤。

2、工業(yè)客戶：間接考察細(xì)胞是否有成瘤的可能性。

端粒酶活性檢測(cè)的主要方案

1、直接檢測(cè)端粒酶（蛋白及RNA的結(jié)合復(fù)合物）的活性，檢測(cè)它是否可以延伸DNA模板，然后跑膠或者探針雜交，檢測(cè)DNA延伸的長(zhǎng)度，以此來判斷端粒酶的活性高低。

該方法操作較復(fù)雜，靈敏度不高。

2、間接檢測(cè)端粒酶（催化亞基的mRNA量）的活性。

該方法靈敏度高，操作相對(duì)簡(jiǎn)便。

YH端粒酶活性檢測(cè)原理

雙色熒光探針分別檢測(cè)端粒酶催化亞基TERT基因mRNA和內(nèi)參基因GAPDH mRNA。在進(jìn)行樣本檢測(cè)時(shí)，同時(shí)檢測(cè)陽性細(xì)胞293T和陰性MRC-5細(xì)胞做為對(duì)照，利用??CT法計(jì)算樣本中TERT基因的相對(duì)表達(dá)量。

檢測(cè)所用主要儀器

熒光定量PCR： Real Time PCR System(ABI 7500，U.S.A)

RNA質(zhì)控：Nanodrop 2000C Spectrophotometer(Thermo scientific，Germany）

檢測(cè)所用試劑

RNA抽提試劑盒：RNAiso Plus kit(Code No.9108/9109，TaKaRa，Japan)

RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒： RevertAid First Strand cDNA Synthesis Kit(00820611，Thermo scientific，Germany)

雙色熒光TERT基因檢測(cè)試劑盒：上海翼和應(yīng)用生物技術(shù)有限公司自研

陽性對(duì)照：293T細(xì)胞

陰性對(duì)照：MRC-5細(xì)胞（正常的人胚肺細(xì)胞）