DNA測序的建庫流程

什么是文庫制備？在待測片段兩端連接特定接頭從而使其符合測序平臺要求的過程。Illumina 芯片Flowcell(流動池)是有著8個lane(泳道)的玻璃板，每個lane可以測一個樣本或者多樣本的混合物，且隨機布滿了能夠與文庫兩端接頭分別互補配對或一致的寡核苷酸(oligos，P7和P5接頭)，一個lane包含兩列，每一列有60個tile（每條lane有120個格子），每個tile有很多個凹坑，會種下不同的cluster（蔟），每個tile在一次循環中會拍照4次(每種堿基一次)，一次反應cycle在每條lane拍120張照片。Illumina 文庫：基于TA連接P5/P7：和芯片上的oligos（P5‘/P7’）可以互補，目的是讓文庫接到芯片上。Index：標簽，也叫Barcode，因為一個lane可以同時測多個樣品，給每個樣本帶個帽子，測序后可以區分誰是誰的。接頭連接：利用TA克隆在DNA片段兩端加上能夠與測序儀配合的接頭序列。DNA建庫流程：DNA片段化、接頭連接、連接產物純化、PCR擴增、擴增產物純化、文庫長度分選片段化由于目前市場中NGS測序儀的測序長度通常在 150-550bp 之間，因此需要使用機械打斷或酶切打斷的方法將大片段基因組DNA片段化為小片段的DNA。片段化酶是隨機內切酶，不受特定酶切位點的限制，隨機切割對應模板DNA，片段化的產物屬于粘性末端，后續需要進行末端修復。酶切形成兩條單鏈末端時，產生末端的核苷酸順序不是平齊的，稱為粘性末端；產生核苷酸順序平齊的末端，則稱為平末端。