DNA甲基化分析

1.什么是DNA甲基化？

DNA甲基化是在DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(Dnmt)的作用下將甲基選擇性地添加到胞嘧啶上形成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的過程。

2.DNA甲基化與基因表達(dá)調(diào)控

DNA復(fù)制后胞嘧啶的甲基化會(huì)改變DNA的構(gòu)象，使DNA的大溝無(wú)法與DNA結(jié)合蛋白正常結(jié)合，從而使這些非編碼區(qū)長(zhǎng)期保持無(wú)表達(dá)活性的狀態(tài)。而有轉(zhuǎn)錄活性的基因可利用非甲基化的啟動(dòng)子來(lái)進(jìn)行轉(zhuǎn)錄表達(dá)。

3.DNA甲基化主要發(fā)生在CpG位點(diǎn)

CpG位點(diǎn)（CpG sites）是指DNA的某個(gè)區(qū)域，其上的堿基序列以胞嘧啶接著鳥嘌呤出現(xiàn)。“CpG"是“C—磷酸—G"的縮寫。 CpG位點(diǎn)在人類基因組上并非隨機(jī)分布，在人類基因組上的頻率為1%。

• DNA甲基化主要發(fā)生在CpG位點(diǎn)。在哺乳動(dòng)物中，70%到80%的CpG位點(diǎn)的胞嘧啶是甲基化的。

• CpG島是一個(gè)富含CpG位點(diǎn)的區(qū)域，通常定義為：一個(gè)長(zhǎng)度至少為200bp的片段

，其GC含量高于60%，主要位于基因的啟動(dòng)子區(qū)（70%的基因）。

二、全基因組甲基化研究策略

優(yōu)點(diǎn)：通量高 ，全基因組范圍；單堿基分辨率。

缺點(diǎn)：成本高，不適于大樣本研究分析；不適于特異位點(diǎn)、基因或區(qū)段研究。

三、特異位點(diǎn)甲基化研究策略

Bisulfite sequencing PCR (BSP): 基因組DNA經(jīng)亞硫酸氫鹽處理后，設(shè)計(jì)BSP引物擴(kuò)增目的片段，最后對(duì)PCR產(chǎn)物進(jìn)行克隆并選取8-10個(gè)轉(zhuǎn)化子序列，即可確定所研究的CpG區(qū)域的甲基化頻率。

Methylation specific PCR (MSP) ：首先用亞硫酸氫鈉修飾處理基因組DNA，然后針對(duì)甲基化和非甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，確定與引物互補(bǔ)的DNA序列的甲基化狀態(tài)。

缺點(diǎn)：通量太小、無(wú)法精確定量

翼和方法：

Bisulfite Amplicon Sequencing (BSAS)

優(yōu)勢(shì)：BSAS 結(jié)合了亞硫酸鹽轉(zhuǎn)換、靶向擴(kuò)增子高通量測(cè)序技術(shù)，可實(shí)現(xiàn)多區(qū)段、多位點(diǎn)的甲基化精確定量分析。

應(yīng)用：1、 適用于感興趣的目的片段的甲基化研究 ；

2、適用于在大樣本中進(jìn)一步確認(rèn)全基因組甲基化研究挑選的陽(yáng)性位點(diǎn)。

文獻(xiàn)：1、 Masser et al. Epigenetics & Chromatin 2013, 6:33

2、Ashktorab et al. Epigenetics 2014, 9(4): 503-512

3、Beth et al. J CHILD PSYCHOL PSYC 2016,2(57):152-160

關(guān)鍵點(diǎn)-引物設(shè)計(jì)

? 盡量避免CpG位點(diǎn)，無(wú)法避免時(shí)，可設(shè)計(jì)兼并引物；

? 經(jīng)亞硫酸鹽處理后，兩條DNA鏈不再互補(bǔ)，一般需要設(shè)計(jì)鏈特異性引物用于PCR擴(kuò)增；

? 如果只選一條鏈進(jìn)行研究，一般選擇正義鏈。

關(guān)鍵點(diǎn)-轉(zhuǎn)換效率

亞硫酸鹽處理是一化學(xué)過程，可造成DNA的損傷，很難同時(shí)實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)換效率和保持DNA的完整性，二者需要做出一定的平衡。

轉(zhuǎn)換效率 = 未轉(zhuǎn)換堿基讀數(shù)/總堿基讀數(shù) 【針對(duì)DNA序列中的C位點(diǎn)】

如何評(píng)估轉(zhuǎn)換效率？

? 在植物中，葉綠體中不含甲基胞嘧啶 DNA，因此，可用葉綠體DNA序列信息作為內(nèi)對(duì)照，評(píng)估轉(zhuǎn)換效率。

? 在動(dòng)物中，可通過在試驗(yàn)中加入未發(fā)生甲基化的外源DNA序列（通常為噬菌體DNA）來(lái)評(píng)估轉(zhuǎn)換效率；此外，還可利用CpG位點(diǎn)以外的C位點(diǎn)信息來(lái)評(píng)估。

關(guān)鍵點(diǎn)-目的片段富集

采用巢式PCR，確保目的片段有效富集

經(jīng)亞硫酸鹽處理后，DNA序列復(fù)雜度嚴(yán)重降低。應(yīng)嚴(yán)格控制建庫(kù)PCR的循環(huán)數(shù)，降低非特異性擴(kuò)增。

關(guān)鍵點(diǎn)-甲基化判斷

通過將參考序列中的C堿基全部替換為T堿基，然后將測(cè)序reads比對(duì)到轉(zhuǎn)換后的參考序列上，針對(duì)每一個(gè)CpG位點(diǎn)，統(tǒng)計(jì)C和T堿基的讀數(shù)（類似于SNP calling），來(lái)判斷該位點(diǎn)的甲基化。

甲基化率：對(duì)于每一個(gè)CpG位點(diǎn)，甲基化率 = C堿基讀數(shù)/該位點(diǎn)測(cè)序覆蓋度。

甲基化狀態(tài)：利用內(nèi)對(duì)照得出的轉(zhuǎn)換效率作為期望概率，通過二項(xiàng)分布統(tǒng)計(jì)，得到p值，判斷每個(gè)CpG位點(diǎn)是否發(fā)生甲基化，多位點(diǎn)分析時(shí)，通常需要對(duì)p值進(jìn)行矯正（錯(cuò)誤發(fā)生率，F(xiàn)DR）。